在生物医学研究领域，无论是体外感染困难的细胞构建慢病毒文库，还是在体内应用AAV文库，研究者一直面临一个困扰的问题：如何确定最佳剂量，以确保每个靶点仅进入一个细胞。文库实验旨在寻找单基因引发的功能变化，因此必须控制每个细胞仅接收带有一个靶点的病毒。

对于细胞实验的文库筛选，建议首先进行对照病毒的预实验，以探索最佳的MOI（感染效率达到80%的MOI）。实践中，文库操作的MOI设定为最佳MOI的三分之一，以显著减少病毒用量，从而降低同一细胞内的重复感染几率。然而，对于像免疫细胞这类难以感染的细胞，以及体内实验，如何确定最佳的剂量依然是一个挑战，因为最佳MOI所能达到的感染效率可能仅为30%。这种情况下，简单的1/3用量可能不足以感染任何细胞。

为了帮助研究者更好地进行文库感染的预实验，尊龙凯时推出了三色荧光病毒（包括mTagBFP、Venus和mCherry），提供了更为有效的解决方案。这些三色荧光病毒涵盖了慢病毒和AAV两种产品类型。相关文献，如《Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq》，展示了在体内探索AAV文库剂量的实验方法。研究者进行了一系列体内滴定实验，以测试AAV是否能在低感染复数下感染更多的细胞。

实验中制备了三种剂量的AAV，具体为25E9、5E9、5E10颗粒数，使用phpb血清型。在CBh启动子的控制下，分别独立表达mTagBFP、Venus及mCherry。通过流式筛选，能有效确定较少剂量并减少双病毒共同感染单个细胞的可能性，从而锁定最佳剂量。最终选择了5E9的剂量，因为它实现了单个AAV感染的细胞总数最大化。

在三色实验中，研究者将三种AAV的等比例混合物注射到不同剂量的LSL-Cas9动物中（低剂量25E9；中剂量50E9；高剂量25E10）。通过监测不同病毒剂量的全身注射后感染细胞核（即表达至少一种荧光蛋白的细胞核）所占的百分比，可以评估感染效果。此外，还分析了单个、双个或三个荧光的感染细胞核百分比。

无论是在细胞实验还是动物实验中，都可以使用尊龙凯时的三色荧光病毒进行相关的预实验，通过设置不同剂量梯度进行细胞感染或进行小鼠的体内注射，并利用流式分析评估转染效率和单荧光细胞比例。最终，通过比较得到单病毒感染比例（单色荧光细胞数量）最高且感染细胞数量比例多的剂量作为最佳剂量，并将此作为文库的实际实验剂量。

参考文献：Santinha, A.J., Klingler, E., Kuhn, M. et al. Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq. Nature 622, 367–375 (2023)